Klon isolieren
Im Allgemeinen wird eine Klonierung durchgeführt, um den Klon eines bestimmten Gens oder einer bestimmten interessierenden DNA-Sequenz zu erhalten. Der nächste Schritt nach dem Klonen besteht daher darin, diesen Klon unter anderen Mitgliedern der Bibliothek zu finden und zu isolieren. Wenn die Bibliothek das gesamte Genom eines Organismus umfasst, ist irgendwo in dieser Bibliothek der gewünschte Klon. Abhängig vom jeweiligen Gen gibt es verschiedene Möglichkeiten, es zu finden. Am häufigsten wird ein kloniertes DNA-Segment, das Homologie zum gesuchten Gen zeigt, als Sonde verwendet. Wenn beispielsweise ein Mausgen bereits kloniert wurde, kann dieser Klon verwendet werden, um den äquivalenten menschlichen Klon aus einer menschlichen genomischen Bibliothek zu finden. Bakterienkolonien, die eine Bibliothek bilden, werden in einer Sammlung von Petrischalen gezüchtet. Dann wird eine poröse Membran über die Oberfläche jeder Platte gelegt und Zellen haften an der Membran. Die Zellen werden aufgebrochen und die DNA in einzelne Stränge aufgeteilt - alle auf der Membran. Die Sonde wird ebenfalls in Einzelstränge getrennt und häufig mit radioaktivem Phosphor markiert. Eine Lösung der radioaktiven Sonde wird dann verwendet, um die Membran zu baden. Die einzelsträngige Sonden-DNA haftet nur an der DNA des Klons, der das äquivalente Gen enthält. Die Membran wird getrocknet und gegen eine Folie aus strahlungsempfindlichem Film gelegt, und irgendwo auf den Filmen erscheint ein schwarzer Fleck, der das Vorhandensein und den Ort des gewünschten Klons anzeigt. Der Klon kann dann aus den Original-Petrischalen abgerufen werden.
Genetik: Rekombinante DNA-Technologie und Polymerasekettenreaktion
Technische Fortschritte haben eine wichtige Rolle beim Fortschritt des genetischen Verständnisses gespielt. 1970 amerikanische Mikrobiologen Daniel Nathans
DNA-Sequenzierung
Sobald ein DNA-Segment kloniert wurde, kann seine Nukleotidsequenz bestimmt werden. Die Nukleotidsequenz ist der grundlegendste Kenntnisstand eines Gens oder Genoms. Es ist die Blaupause, die die Anweisungen zum Aufbau eines Organismus enthält, und kein Verständnis der genetischen Funktion oder Evolution könnte vollständig sein, ohne diese Informationen zu erhalten.
Verwendet
Die Kenntnis der Sequenz eines DNA-Segments hat viele Verwendungszwecke, und es folgen einige Beispiele. Erstens kann es verwendet werden, um Gene zu finden, DNA-Segmente, die für ein bestimmtes Protein oder einen bestimmten Phänotyp kodieren. Wenn eine DNA-Region sequenziert wurde, kann sie auf charakteristische Merkmale von Genen untersucht werden. Beispielsweise empfehlen offene Leserahmen (ORFs) - lange Sequenzen, die mit einem Startcodon beginnen (drei benachbarte Nukleotide; die Sequenz eines Codons bestimmt die Aminosäureproduktion) und nicht durch Stoppcodons unterbrochen werden (mit Ausnahme eines bei ihrer Beendigung) - a Protein-kodierende Region. Außerdem grenzen menschliche Gene im Allgemeinen an sogenannte CpG-Inseln - Cluster von Cytosin und Guanin, zwei der Nukleotide, aus denen die DNA besteht. Wenn bekannt ist, dass sich ein Gen mit einem bekannten Phänotyp (wie ein Krankheitsgen beim Menschen) in der sequenzierten chromosomalen Region befindet, werden nicht zugeordnete Gene in der Region zu Kandidaten für diese Funktion. Zweitens können homologe DNA-Sequenzen verschiedener Organismen verglichen werden, um evolutionäre Beziehungen sowohl innerhalb als auch zwischen Arten darzustellen. Drittens kann eine Gensequenz auf funktionelle Regionen gescreent werden. Um die Funktion eines Gens zu bestimmen, können verschiedene Domänen identifiziert werden, die Proteinen mit ähnlicher Funktion gemeinsam sind. Beispielsweise finden sich bestimmte Aminosäuresequenzen innerhalb eines Gens immer in Proteinen, die eine Zellmembran überspannen. Solche Aminosäurestrecken werden Transmembrandomänen genannt. Wenn eine Transmembrandomäne in einem Gen mit unbekannter Funktion gefunden wird, deutet dies darauf hin, dass sich das kodierte Protein in der Zellmembran befindet. Andere Domänen charakterisieren DNA-bindende Proteine. Für jede interessierte Person stehen mehrere öffentliche Datenbanken mit DNA-Sequenzen zur Analyse zur Verfügung.
